支原體污染一直是細(xì)胞生物學(xué)研究面臨的主要問(wèn)題之一，因?yàn)樗鼈儠?huì)影響或改變細(xì)胞的生理機(jī)能。由于其寄生特性和適應(yīng)宿主細(xì)胞的能力，支原體經(jīng)常作為污染物出現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)物中。 [1]
支原體沒(méi)有細(xì)胞壁。出于這個(gè)原因，它們對(duì)靶向細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗生素（例如pen/strep）不敏感，這些抗生素通常用于細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞壁的缺乏以及它們的小尺寸（通常為 0.2 - 0.3 ?m）也使它們?cè)趥鹘y(tǒng)顯微鏡下的檢測(cè)變得復(fù)雜。它們的小尺寸和非常靈活的形式也意味著支原體不能通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾從液體介質(zhì)中去除。
由于缺乏宏觀效應(yīng)，支原體可能長(zhǎng)期未被發(fā)現(xiàn)。特別是在使用標(biāo)準(zhǔn)抗生素的日常工作中，實(shí)驗(yàn)室工作人員的支原體污染可能會(huì)在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)未被發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槠渌?xì)菌的污染通過(guò)添加抗生素而被選擇性抑制，而同時(shí)引入的支原體可以不受阻礙地繁殖。
鑒于此，許多研究表明細(xì)胞培養(yǎng)物的支原體污染水平高達(dá) 40% 也就不足為奇了。這些高污染水平的一個(gè)可能原因被認(rèn)為是由實(shí)驗(yàn)室工作人員、血清或胰蛋白酶、外來(lái)細(xì)胞培養(yǎng)物（交叉污染）或最終由收獲細(xì)胞培養(yǎng)物的動(dòng)物引入的。 [3]
文獻(xiàn)：
1. HG Drexler, C. Uphoff；Cytotechnology 39(2), 75 – 90 (2002) [PubMed ID: 19003295]
2. 照片：M. Rohde, GBF, Braunschweig; C. Uphoff, DSMZ, Braunschweig
3. T. Lindl, J. Bauer：“Zell- und Gewebekultur"；Gustav Fischer 出版社，斯圖加特 (1987)；RJ Hay、ML Macy、TR Chen；Nature 339, 487 (1989) [PubMed ID: 2725683]
由于污染的存在會(huì)影響從細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的結(jié)果的準(zhǔn)確性，或者在最壞的情況下，會(huì)損害細(xì)胞生長(zhǎng)到整個(gè)培養(yǎng)物丟失的程度，因此必須定期檢查細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在支原體污染。特別是在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中必須排除支原體污染，因?yàn)槲廴緦?duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的負(fù)面影響會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率急劇下降。
支原體是軟體菌類中的幾個(gè)細(xì)菌屬之一。軟體動(dòng)物是人類、動(dòng)物和植物的微小寄生蟲(chóng)或共生體；根據(jù)定義，支原體屬的 100 多種*物種僅限于脊椎動(dòng)物宿主，在那里它們被稱為許多疾病的病原體（例如由肺炎支原體引起的肺炎）。
細(xì)胞表面支原體菌落的電子顯微鏡圖像 [2]
支原體細(xì)胞非常小，沒(méi)有細(xì)胞壁。因此，它們不受靶向細(xì)胞壁合成的抗生素的影響。支原體的基因組大小范圍為 0.58 – 1.38 兆堿基對(duì)，GC 含量低 (18 – 40 mol%)，是所有具有自動(dòng)復(fù)制能力的原核生物中最小的。
作為需氧或兼性厭氧生物，支原體與其宿主理想地對(duì)齊，因此因此在細(xì)胞培養(yǎng)物 (37°C) 中找到最佳生長(zhǎng)條件。
...損害細(xì)胞生長(zhǎng)
...降低宿主細(xì)胞的代謝活性
...調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生
...在體外誘導(dǎo)染色體畸變
...通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌過(guò)濾器
...對(duì)抗生素如青霉素或鏈霉素具有抗性通常用于細(xì)胞培養(yǎng)
...耐高溫和脫水
...影響轉(zhuǎn)染效率
支原體可以在幾乎所有已知的細(xì)胞類型中增殖，因此無(wú)處不在。據(jù)估計(jì)，大約 80% 的日本細(xì)胞培養(yǎng)物、65% 的阿根廷細(xì)胞培養(yǎng)物和 15% 的美國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染。該圖顯示了支原體污染對(duì) HeLa 細(xì)胞生長(zhǎng)的廣泛影響。
由于支原體污染具有不可見(jiàn)且不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的特殊特性，因此污染可能會(huì)在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)未被發(fā)現(xiàn)。然而，這些細(xì)菌對(duì)轉(zhuǎn)染成功有廣泛的影響：
• 由于精氨酸需求增加，細(xì)胞生長(zhǎng)顯著減少
• 支原體調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生
• 支原體導(dǎo)致染色體畸變
• 支原體滯留在細(xì)胞膜中，并可能調(diào)節(jié)細(xì)胞膜過(guò)程，例如內(nèi)吞作用。
所有這些操縱的生理過(guò)程也參與轉(zhuǎn)染過(guò)程。該圖顯示了支原體污染對(duì) HeLa 和 HepG2 細(xì)胞的廣泛影響：與未污染細(xì)胞相比，效率分別提高了 17% 和 5.6%。
在 48 孔板上用 pCMV?gal 轉(zhuǎn)染 HeLa 和 HepG2 細(xì)胞。通過(guò) ONPG 和 BCA 分析評(píng)估比吸收值。左邊的條形顯示由支原體污染導(dǎo)致的轉(zhuǎn)染效率大大降低。
DAPI染色
在細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測(cè)支原體的一個(gè)流行應(yīng)用是用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色細(xì)胞。DAPI 強(qiáng)烈嵌入 DNA 的小溝中，并在紫外線激發(fā)下在最大 460 nm 處顯示出相對(duì)較寬的熒光發(fā)射。在無(wú)支原體細(xì)胞培養(yǎng)中，僅標(biāo)記細(xì)胞核。如果存在支原體細(xì)胞，它們的 DNA 也會(huì)被標(biāo)記。由于它們的體積小，單個(gè)支原體細(xì)胞無(wú)法在熒光顯微鏡下分辨：只有高度污染會(huì)導(dǎo)致可見(jiàn)的模糊面紗形成，這可能無(wú)法清楚地識(shí)別。
聚合酶鏈反應(yīng)
更靈敏的支原體檢測(cè)方法是 PCR。可以在非常早期的污染和低濃度狀態(tài)下檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中的支原體。這種檢測(cè)方法通常適用于細(xì)胞培養(yǎng)工作。
其他
雖然 ELISA 測(cè)試經(jīng)常用于支原體的常規(guī)檢測(cè)，但這種方法在靈敏度和特異性方面并不優(yōu)于 DAPI 測(cè)試。另一種方法是電子顯微鏡，然而，它需要先進(jìn)的設(shè)備并且更耗時(shí)。
結(jié)論
為確保細(xì)胞培養(yǎng)物中支原體污染引起的諸多問(wèn)題最終成為過(guò)去，Biontex 提供了一系列基于 PCR 的檢測(cè)支原體檢測(cè)試劑盒：
MycoSPY®（常規(guī) PCR 檢測(cè)試劑盒）
MycoSPY® Master Mix（ PCR 檢測(cè)試劑盒，包括 Master Mix 和用于凝膠電泳的上樣緩沖液和示蹤染料
該產(chǎn)品對(duì)已建立的細(xì)胞系和原代細(xì)胞均取得了優(yōu)異的結(jié)果。
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用 DAPI 染色的 Cos7 細(xì)胞，無(wú) | DAPI 染色未能揭示 |
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當(dāng)存在* 水平的支原體污染時(shí)，這些 DAPI 染色的 H441-Luc 細(xì)胞僅在細(xì)胞外圍 | 所有這三種 |
| 方法 | DAPI-測(cè)試 | 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) | MycoSPY® | 電子顯微鏡 |
|---|---|---|---|---|
| 努力 | + | + | + | -- |
| 費(fèi)用 | ++ | 0 | + | -- |
| 靈敏度 | -- | - | ++ | + |
| 全部的 | + | 0 | ++++ | --－ |
對(duì)于被細(xì)菌污染的細(xì)胞培養(yǎng)物的處理，通常使用標(biāo)準(zhǔn)抗生素。但是作用于細(xì)胞壁的抗生素（如青霉素）對(duì)支原體無(wú)效。
因此，我們提供產(chǎn)品MycoRAZOR®，這是一種抗生素混合物，可損害蛋白質(zhì)生物合成（轉(zhuǎn)錄和翻譯）。
是的。重要的是檢查支原體是否已被MycoRAZOR®（例如，通過(guò)使用MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix）*消除，以防止產(chǎn)生耐藥性。由于耐藥性的產(chǎn)生方式與所有抗生素的使用方式相同，因此*消除支原體至關(guān)重要。
首先檢查是否在上次使用MycoRAZOR®和當(dāng)前測(cè)試之間進(jìn)行了兩次未使用MycoRAZOR®的傳代。如果不是這種情況，則可能已檢測(cè)到死支原體，特別是通過(guò)高度敏感的方法，例如 PCR。如果觀察到最后一次應(yīng)用和測(cè)試之間的最短時(shí)間，請(qǐng)在接下來(lái)的五次細(xì)胞傳代中使用MycoRAZOR®，逐漸增加MycoRAZOR®的劑量，最大稀釋度為 1/25。請(qǐng)注意，根據(jù)細(xì)胞類型，增加MycoRAZOR®的濃度可能會(huì)產(chǎn)生毒性作用. 如果您在細(xì)胞中觀察到毒性作用（增殖率降低；細(xì)胞形態(tài)變化），請(qǐng)?jiān)谑Ｓ嘀芷谥惺褂米詈笠淮问褂玫膭┝俊?/span>必須使用支原體檢測(cè)試劑盒（例如MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix）測(cè)試每種治療的結(jié)果！
細(xì)胞培養(yǎng)中使用的動(dòng)物產(chǎn)品是支原體污染的主要來(lái)源。為避免這種風(fēng)險(xiǎn)，請(qǐng)僅使用保證不含支原體的胎牛血清 (FBS) 和胰蛋白酶。
支原體屬于 Mollicutes 類，因此缺乏細(xì)胞壁，它們對(duì)許多攻擊細(xì)胞壁合成的抗生素具有抗性。因此，在將此類抗生素（例如青霉素/鏈霉素）用于細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)使用中，使用者本身是重要的污染源。在這種情況下，非無(wú)菌工作條件會(huì)被忽視，因?yàn)樘砑涌股貢?huì)阻止大多數(shù)細(xì)菌的生長(zhǎng)——從而阻止宏觀效應(yīng)——同時(shí)允許支原體不受阻礙地繁殖。
此外，來(lái)自另一種細(xì)胞培養(yǎng)物的交叉污染是可能的。出于這個(gè)原因，始終測(cè)試所有培養(yǎng)的細(xì)胞并更換任何可能被污染的細(xì)胞培養(yǎng)材料（培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶、緩沖液）。
第MycoRAZOR®不包含任何doxy-或四環(huán)素類抗生素。
大多數(shù)基于 PCR 的支原體檢測(cè)試劑盒都包含一個(gè)質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，該質(zhì)粒編碼支原體的 16S rRNA。這確保了引物的功能。如果存在支原體污染，該質(zhì)粒產(chǎn)生的 DNA 擴(kuò)增子的大小與預(yù)期的相同或相似。因此，帶有陽(yáng)性對(duì)照的 PCR 必須在單獨(dú)的管中進(jìn)行。通常還包括內(nèi)部對(duì)照，以確保 PCR 不受來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)上清液的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片的抑制。內(nèi)部對(duì)照產(chǎn)生與支原體污染的細(xì)胞樣本不同長(zhǎng)度的 DNA 擴(kuò)增子。因此，內(nèi)部控制可以在每種方法中進(jìn)行。
MycoSPY® Master Mix試劑盒和MycoSPY®試劑盒中包含的內(nèi)部對(duì)照是一種質(zhì)粒，它編碼支原體 16S rRNA 的縮短形式。因此，內(nèi)部對(duì)照用作陽(yáng)性對(duì)照，并確保對(duì)于每種 PCR 方法，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中不存在抑制劑。因此，它排除了假陰性結(jié)果。
兩者MycoSPY®主混合物的試劑盒和MycoSPY®試劑盒檢測(cè)至少80份支原體基因組的。內(nèi)部控制稍微降低了靈敏度。由于支原體在細(xì)胞培養(yǎng)物受到污染后繁殖相對(duì)較快，因此這種敏感性就足夠了。
因此，我們建議在每次 PCR 中添加內(nèi)部對(duì)照，以確保不存在來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)上清液的任何現(xiàn)有抑制劑（蛋白質(zhì)、細(xì)胞碎片）。
沒(méi)有必要避免使用常規(guī)抗生素，例如青霉素、鏈霉素或慶大霉素，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)抑制MycoSPY® Master Mix Kit 或MycoSPY®試劑盒的檢測(cè)。
是的。我們建議在 20°C 下儲(chǔ)存，不含添加劑（例如 DMSO）。解凍后，應(yīng)按照手冊(cè)中的說(shuō)明制備細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
我們建議將細(xì)胞培養(yǎng)至少 48-72 小時(shí)，或直到生長(zhǎng)區(qū)域的覆蓋率至少達(dá)到 80%。對(duì)于懸浮細(xì)胞，細(xì)胞密度應(yīng)大約在推薦用于傳代培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)。由于在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測(cè)到支原體，因此在此期間不應(yīng)更換培養(yǎng)基。
我們建議至少每 1-2 個(gè)月進(jìn)行一次支原體 PCR（例如使用MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix），尤其是在存在抗生素（例如 pen/strep）的情況下培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)。這些抗生素可防止發(fā)現(xiàn)未消毒的工作技術(shù)，但會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物受到支原體污染。
