rtalabs DIAGNOVITAL®2019-NCOV

使用說(shuō)明
1） 預(yù)期用途
本文介紹了實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)在體外定性檢測(cè)中的應(yīng)用
2019年呼吸道標(biāo)本和血清中的新型冠狀病毒（2019 nCoV）。2019 nCoV引物和探針組設(shè)計(jì)用于2019 nCoV的特定檢測(cè)。
這些試劑盒遵循疾控中心和世衛(wèi)組織的新檢測(cè)指南。
2） DIAGNOVITAL®檢測(cè)
DIAGNOVITAL®2019-NCOV是基于RT-PCR的2019武漢冠狀病毒（2019-NCOV）實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)。2019年nCoV被認(rèn)為是一種新的人類冠狀病毒，與引起季節(jié)性急性呼吸系統(tǒng)疾病的常見(jiàn)人類冠狀病毒（229E，NL63，OC43，HKU1）有著明顯的遺傳差異。它在基因上也不同于兩個(gè)新人類
冠狀病毒、MERS-CoV和SARS-CoV。

DIAGNOVITAL®2019-NCOV檢測(cè)到2019年NCOV存在3個(gè)不同且高度特異的基因序列：E基因、N基因和RdRP基因。所有3項(xiàng)化驗(yàn)必須檢測(cè)為陽(yáng)性，以確認(rèn)樣本為2019 nCoV陽(yáng)性。
此外，還包括非感染性陽(yáng)性對(duì)照和陰性人類提取對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照用于確認(rèn)分析的功能和總體PCR性能，陰性人類提取對(duì)照用于評(píng)估獨(dú)立于2019年nCoV分析的RNA分離質(zhì)量。

2.1）基于QPCR的2019-NCOV檢測(cè)
檢測(cè)2019株nCoV的一步是將病毒RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。之后，通過(guò)熒光標(biāo)記探針，對(duì)2019年nCoV*的目標(biāo)序列進(jìn)行實(shí)時(shí)放大監(jiān)測(cè)：當(dāng)加入新擴(kuò)增的DNA鏈時(shí)，熒光團(tuán)（FAM™) 被釋放，可以觀察到熒光信號(hào)的增加。
由于冠狀病毒的固有突變率，目標(biāo)序列中的突變有可能隨著時(shí)間的推移而發(fā)生和積累。這可能導(dǎo)致基于PCR的檢測(cè)方法出現(xiàn)假陰性結(jié)果。DIAGNOVITAL®2019-NCOV通過(guò)對(duì)3個(gè)不同的目標(biāo)序列使用3種檢測(cè)分析來(lái)解決此問(wèn)題，以大限度地減少由改變的目標(biāo)序列導(dǎo)致假陰性結(jié)果的機(jī)會(huì)。
如果樣品在一個(gè)或多個(gè)分析中檢測(cè)為陰性，則可能需要額外的補(bǔ)充檢測(cè)。2019年nCoV的原始靶序列作為非感染性靶陽(yáng)性對(duì)照（TPC）包括在內(nèi)，以檢查檢測(cè)分析的完整性。
應(yīng)始終通過(guò)補(bǔ)充方法和獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室中的附加分析來(lái)確認(rèn)檢測(cè)呈陽(yáng)性的樣品。

PRODUCT SIZE SKU

DIAGNOVITAL®2019-NCOV

50 rxn / 20 µl PCC

SKU15259

2.2) MATERIALS PROVIDED

QUANTITY AND VOLUME COMPONENT

2.3）所需附加材料
•核酸提取的適當(dāng)方法和設(shè)備（見(jiàn)第3.4章）
•為FAM配備實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)™ 偵查
•可調(diào)移液管和安裝過(guò)濾移液管頭
•適當(dāng)?shù)腜SA和工作區(qū)，用于處理潛在感染性樣本
•表面去污劑，如DNAZap™ （生命科技），遠(yuǎn)離DNA™ （費(fèi)舍爾科學(xué)），離開(kāi)™ （Fisher Scientific），10%漂白劑（市售5.25-6.0%次氯酸鈉的1:10稀釋度）
•無(wú)核酸酶管/條/板，用于制備稀釋液、主混合物等；與PCR裝置相對(duì)應(yīng)的無(wú)核酸酶管/條/板
•試劑和樣品的適當(dāng)儲(chǔ)存選擇（4℃、-20℃、-70℃）

2.4）儲(chǔ)存
•將所有部件儲(chǔ)存在-20°C下，避免重復(fù)凍融循環(huán)。•保護(hù)2X qPCR主混合料不受光照，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間曝光會(huì)降低熒光粉的性能。

3） 開(kāi)始前的注意事項(xiàng)
3.1）生物安全•穿戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)裝備（如長(zhǎng)袍、無(wú)粉手套，
當(dāng)使用臨床樣本時(shí)。•應(yīng)按照生物安全2級(jí)或更高級(jí)別的指南，在經(jīng)認(rèn)證的二級(jí)生物安全柜中進(jìn)行樣本處理。

3.2）試樣
僅使用適當(dāng)?shù)臉颖具M(jìn)行測(cè)試，例如：•呼吸樣本，包括鼻咽/口咽抽吸物或沖洗液、鼻咽/口咽拭子、支氣管肺泡灌洗液、氣管抽吸物和痰。•拭子樣本只能在帶有合成的拭子上采集（例如
聚酯或滌綸（帶鋁或塑料軸）。不接受含有海藻酸鈣的棉簽或帶有木軸的棉簽
3.3）試樣-搬運(yùn)和儲(chǔ)存
•采集后，樣品可在4°C下保存72小時(shí)。
•如果預(yù)計(jì)提取會(huì)延遲，則將樣品儲(chǔ)存在-70°C或更低的溫度下。
•提取的核酸應(yīng)儲(chǔ)存在-70°C或更低的溫度下。
如果
•未將其保存在2-4°C（≤4天）或在-70°C或更低溫度下冷凍。
•標(biāo)簽不足或缺乏文件。
•它們不適用于此目的（有關(guān)合適的樣品材料，見(jiàn)上文）。
•樣本容量不足。

3.4）樣品制備/核酸提取：RT-PCR檢測(cè)的性能很大程度上取決于樣品模板RNA的量和質(zhì)量。強(qiáng)烈建議在測(cè)試樣本之前，對(duì)回收和純度的RNA提取程序進(jìn)行鑒定和驗(yàn)證。•與DIAGNOVITAL®檢測(cè)試劑盒成功結(jié)合使用的合適核酸提取系統(tǒng)包括：bioMérieux NucliSens®系統(tǒng)、QIAamp®病毒RNA小試劑盒、QIAamp®Minelote病毒自旋試劑盒或RNeasy®小試劑盒（QIAGEN）、EZ1 DSP病毒試劑盒（QIAGEN）、Roche MagNA Pure Compact RNA分離試劑盒、Roche MagNA Pure
緊湊型核酸分離試劑盒、羅氏麥格納純96 DNA和病毒核酸小容量試劑盒、Invitrogen ChargeSwitch®總RNA細(xì)胞試劑盒。
•將剩余樣本和提取的核酸保存在-70°C下。•僅解凍一天內(nèi)要測(cè)試的樣本提取物數(shù)量。

•測(cè)試前不要冷凍/解凍提取物超過(guò)一次，因?yàn)槊看卫鋬?解凍循環(huán)都會(huì)降低RNA質(zhì)量。•根據(jù)樣本類型，可以直接使用患者樣本。
然而，這可能需要預(yù)先的溶解步驟和滴定樣品上的量，可以在不抑制反應(yīng)的情況下使用。此過(guò)程尚未驗(yàn)證，請(qǐng)使用
建議分離RNA。
3.5）反應(yīng)裝置
1） 在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前，確保所有必要的設(shè)備和裝置都是合適的、校準(zhǔn)的和功能正常的。
2） 對(duì)設(shè)備和工作區(qū)進(jìn)行凈化，并準(zhǔn)備好以下實(shí)驗(yàn)所需的一切，以保持工作流程的簡(jiǎn)短和可重復(fù)性。
3） 打開(kāi)PCR檢測(cè)系統(tǒng)并對(duì)其進(jìn)行編程，以避免在設(shè)置反應(yīng)后出現(xiàn)延遲。
4） 在冰上解凍DIAGNOVITAL®2019-NCOV的所有成分，并輕輕但*地混合，以確保成分均勻分布。快速旋轉(zhuǎn)收集管底部的液體。
5） 對(duì)于一個(gè)測(cè)試，準(zhǔn)備一系列的RNA稀釋來(lái)確定理想的濃度窗口。建議的樣品體積小于終反應(yīng)體積的10%。
6） 設(shè)置Mastermix板：

a、 務(wù)*無(wú)核酸酶的二氧化二氫（dH2O）代替樣品材料（NTC）制備對(duì)照反應(yīng)，以檢測(cè)試劑中的污染。
b、 始終包括陰性人類提取控制（HEC）的分析，以評(píng)估您的RNA分離物的質(zhì)量。
c、 當(dāng)使用提供的靶陽(yáng)性對(duì)照品（TPC）時(shí)，使用1微升/反應(yīng)，并將無(wú)核酸酶的dH2O添加到20微升。
d、 強(qiáng)烈推薦2份以上的復(fù)制品/樣品。
e、 為所有計(jì)劃的反應(yīng)準(zhǔn)備足夠的混料。建議為2個(gè)附加反應(yīng)制備mastermix，以補(bǔ)償移液誤差。
f、 將混合料分發(fā)到板條/盤子中。示例設(shè)置如圖1所示。

OMPONENT VOLUME

50X DIAGNOVITAL®Reverse Transcriptase 0.4 µl

DIAGNOVITAL®2X qPCR Mastermix (E / N / RdRP / HEC) 10 µl

isolated sample RNA / TPC X µl / 1 µl

Nuclease-free dH2O to 20 µl

7） 將Mastermix板轉(zhuǎn)移到單獨(dú)的工作區(qū)以添加樣品材料。
在單獨(dú)的工作區(qū)準(zhǔn)備試劑和終反應(yīng)裝置有助于避免設(shè)備和試劑與樣品材料的污染。
a、 在處理陽(yáng)性樣品之前，先準(zhǔn)備好陰性反應(yīng)并密封。建議在制備和密封NTC后，僅將潛在陽(yáng)性樣品材料和包含的目標(biāo)陽(yáng)性對(duì)照品帶到工作區(qū)。
b、 將您的樣品添加到Mastermix板中。示例設(shè)置如圖2所示。